کاربرد اسپکتروفتومتر در آنالیز بیوشیمیایی و تعیین غلظت پروتئین‌ها
اسپکتروفتومتری یکی از تکنیک‌های پرکاربرد و اساسی در زیست‌شناسی مولکولی، بیوشیمی و علوم مرتبط است که برای اندازه‌گیری غلظت پروتئین‌ها و سایر مولکول‌های زیستی استفاده می‌شود. این روش بر اساس اصل جذب نور توسط مولکول‌ها در طول‌موج‌های خاص عمل می‌کند و به دلیل دقت بالا، سادگی و قابلیت استفاده در آزمایشگاه‌های مدرن، به‌طور گسترده‌ای مورد پذیرش قرار گرفته است. در این متن، به بررسی کاربرد اسپکتروفتومتر در آنالیز بیوشیمیایی، به‌ویژه در تعیین غلظت پروتئین‌ها، پرداخته می‌شود.
اصول اولیه اسپکتروفتومتری
اسپکتروفتومتر دستگاهی است که شدت نور عبوری از یک نمونه را در طول‌موج‌های مشخص اندازه‌گیری می‌کند. این تکنیک بر اساس قانون بِر-لامبرت (Beer-Lambert Law) عمل می‌کند
در این معادله، پروتئین‌ها به دلیل حضور گروه‌های آروماتیک در اسیدهای آمینه مانند تریپتوفان، تیروزین و فنیل‌آلانین، نور در محدوده فرابنفش (UV) با طول‌موج حدود ۲۸۰ نانومتر را جذب می‌کنند. این ویژگی، پایه‌ای برای تعیین غلظت پروتئین‌ها فراهم می‌کند.
کاربرد اسپکتروفتومتر در تعیین غلظت پروتئین‌ها
یکی از رایج‌ترین روش‌های استفاده از اسپکتروفتومتر، اندازه‌گیری جذب نور در ۲۸۰ نانومتر (A280) برای پروتئین‌های خالص است. این روش به دلیل سادگی و عدم نیاز به معرف‌های شیمیایی اضافی، برای نمونه‌های خالص پروتئینی مناسب است. با این حال، در نمونه‌های پیچیده‌تر که ممکن است حاوی نوکلئیک اسیدها یا مواد مزاحم باشند، روش‌های تکمیلی مانند استفاده از رنگ‌آمیزی با برادفورد یا لووری (Lowry) در ترکیب با اسپکتروفتومتر اعمال می‌شود.
روش A280: این روش مستقیماً جذب ذاتی پروتئین‌ها را اندازه‌گیری می‌کند. برای پروتئین‌های استاندارد مانند بومین سرم گاوی (BSA)، نسبت جذب در ۲۸۰ نانومتر به ۲۶۰ نانومتر (A280/A260) می‌تواند برای ارزیابی خلوص پروتئین استفاده شود. اگر این نسبت نزدیک به ۱.۸ باشد، نشان‌دهنده خلوص بالای نمونه است.
روش برادفورد: در این تکنیک، رنگ کوماسی بریلیانت بلو G-250 با گروه‌های آمینی پروتئین‌ها واکنش داده و تغییر رنگ ایجاد می‌کند که در ۵۹۵ نانومتر قابل اندازه‌گیری است. این روش برای نمونه‌های با غلظت پایین و در حضور مواد مزاحم مؤثر است.
روش لووری: این روش حساس‌تر است و بر اساس واکنش پروتئین‌ها با مس(II) در محیط قلیایی و کاهش فولین-سیوکالتو عمل می‌کند. جذب در ۷۵۰ نانومتر اندازه‌گیری می‌شود و برای پروتئین‌های پیچیده مناسب است.
مزایا و محدودیت‌ها
اسپکتروفتومتری به دلیل سرعت بالا، دقت قابل‌قبول و نیاز به حجم کم نمونه، یک ابزار ایده‌آل در آزمایشگاه‌ها محسوب می‌شود. با این حال، محدودیت‌هایی نیز دارد. برای مثال، حضور نوکلئیک اسیدها در ۲۶۰ نانومتر جذب بالایی دارند و می‌توانند نتایج A280 را مختل کنند. همچنین، روش‌های رنگی مانند برادفورد ممکن است برای پروتئین‌های با ساختار خاص (مانند پروتئین‌های غنی از پرولین) دقت کمتری داشته باشند.
کاربردهای عملی در بیوشیمی
کنترل کیفیت: در تولید پروتئین‌های نوترکیب (مانند آنتی‌بادی‌ها)، اسپکتروفتومتر برای اطمینان از غلظت و خلوص محصول استفاده می‌شود.
تحقیقات دارویی: تعیین غلظت پروتئین‌ها در فرمولاسیون داروها و ارزیابی فعالیت بیولوژیکی آن‌ها.
زیست‌فناوری: اندازه‌گیری غلظت آنزیم‌ها و پروتئین‌های کلیدی در فرآیندهای تخمیر.
پیشرفت‌های اخیر
با توسعه اسپکتروفتومترهای مدرن، مانند دستگاه‌های میکرووولوم (Microvolume Spectrophotometers)، اندازه‌گیری در حجم‌های نانولیتری ممکن شده است. این دستگاه‌ها، مانند NanoDrop، دقت بالایی در نمونه‌های کم‌حجم ارائه می‌دهند و برای تحقیقات ژنومی و پروتئومیکس بسیار مفید هستند (Desjardins et al., 2009).
نتیجه‌گیری
اسپکتروفتومتری ابزاری ضروری در آنالیز بیوشیمیایی است که با روش‌های متنوعی مانند A280، برادفورد و لووری، امکان تعیین دقیق غلظت پروتئین‌ها را فراهم می‌کند. این تکنیک با ترکیب سادگی و دقت، نقش کلیدی در تحقیقات علمی و صنعتی دارد و با پیشرفت‌های فناوری، کاربرد آن همچنان در حال گسترش است.
منابع:
Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., & Gray, T. (1995). How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Science, 4(11), 2411-2423
Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72(1-2), 248-254
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., & Randall, R. J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry, 193(1), 265-275
Noble, J. E., & Bailey, M. J. A. (2009). Quantitation of protein. Methods in Enzymology, 463, 73-95
Desjardins, P., Hansen, J. B., & Allen, M. (2009). Microvolume protein concentration determination using the NanoDrop 2000c spectrophotometer. Journal of Visualized Experiments, (33), e1610
