استفاده از دستگاه الکتروفورز (مانند ژل آگارز و PAGE) در آنالیز DNA و پروتئین‌ها

 

الکتروفورز یکی از تکنیک‌های بنیادین در زیست‌شناسی مولکولی و بیوشیمی است که برای جداسازی، شناسایی، و آنالیز مولکول‌های زیستی مانند DNA، RNA، و پروتئین‌ها به کار می‌رود. این روش با استفاده از میدان الکتریکی، مولکول‌ها را بر اساس اندازه، بار الکتریکی، یا ویژگی‌های ساختاری آن‌ها در یک ماتریکس (مانند ژل آگارز یا پلی‌آکریل‌آمید) جدا می‌کند. الکتروفورز ژل آگارز و الکتروفورز پلی‌آکریل‌آمید (PAGE) دو نوع رایج این تکنیک هستند که هر کدام کاربردهای خاص خود را در آنالیز مواد زیستی دارند. این مقاله به بررسی اصول، روش‌ها، کاربردها، مزایا، و محدودیت‌های الکتروفورز ژل آگارز و PAGE در آنالیز DNA و پروتئین‌ها می‌پردازد و نقش آن‌ها در تحقیقات علمی و تشخیص‌های بالینی را مورد بحث قرار می‌دهد.

اصول عملکرد الکتروفورز

الکتروفورز بر اساس حرکت مولکول‌های باردار در یک میدان الکتریکی عمل می‌کند. مولکول‌های زیستی مانند DNA و پروتئین‌ها به دلیل وجود گروه‌های باردار (مانند گروه‌های فسفات در DNA یا گروه‌های اسیدی و بازی در پروتئین‌ها) در حضور جریان الکتریکی حرکت می‌کنند. در این روش، نمونه‌ها در یک ماتریکس ژلی (مانند آگارز یا پلی‌آکریل‌آمید) قرار داده می‌شوند که به عنوان یک غربال مولکولی عمل می‌کند. مولکول‌های کوچک‌تر سریع‌تر از مولکول‌های بزرگ‌تر از میان منافذ ژل عبور می‌کنند و به این ترتیب جداسازی بر اساس اندازه انجام می‌شود.
در الکتروفورز، نمونه‌ها در یک سر ژل قرار می‌گیرند و تحت تأثیر میدان الکتریکی به سمت الکترود مقابل حرکت می‌کنند. برای DNA، که دارای بار منفی است، حرکت به سمت الکترود مثبت (آند) خواهد بود، در حالی که پروتئین‌ها بسته به بار خالص خود (که به pH محیط وابسته است) ممکن است به سمت آند یا کاتد حرکت کنند. پس از جداسازی، مولکول‌ها با استفاده از رنگ‌آمیزی (مانند اتیدیوم بروماید برای DNA یا کوماسی بلو برای پروتئین‌ها) قابل مشاهده می‌شوند.

الکتروفورز ژل آگارز

الکتروفورز ژل آگارز یکی از پرکاربردترین روش‌ها برای آنالیز DNA و RNA است. آگارز، یک پلی‌ساکارید استخراج‌شده از جلبک دریایی، به عنوان ماتریکس ژلی استفاده می‌شود که با توجه به غلظت آن، منافذ متفاوتی برای جداسازی مولکول‌ها ایجاد می‌کند.

اصول و آماده‌سازی ژل آگارز

ژل آگارز با حل کردن پودر آگارز در یک بافر (مانند TAE یا TBE) و حرارت دادن آن تهیه می‌شود. پس از خنک شدن، ژل در یک قالب ریخته شده و با ایجاد چاهک‌هایی برای بارگذاری نمونه‌ها آماده می‌شود. غلظت آگارز (معمولاً بین ۰.۵ تا ۲ درصد) بر اساس اندازه مولکول‌های مورد نظر تنظیم می‌شود؛ ژل‌های با غلظت بالاتر برای جداسازی مولکول‌های کوچک‌تر و ژل‌های با غلظت پایین‌تر برای مولکول‌های بزرگ‌تر مناسب هستند.

کاربردهای الکتروفورز ژل آگارز

• آنالیز DNA و RNA:

الکتروفورز ژل آگارز به طور گسترده برای بررسی اندازه قطعات DNA (مانند محصولات PCR، DNA پلاسمیدی، یا DNA ژنومی) استفاده می‌شود. این روش برای تأیید وجود یک قطعه خاص DNA، بررسی کیفیت RNA، یا تعیین اندازه قطعات DNA در فرآیند کلونینگ مولکولی کاربرد دارد.

• تشخیص جهش‌های ژنتیکی:

الکتروفورز ژل آگارز در روش‌هایی مانند RFLP (پلی‌مورفیسم طول قطعات محدود شده) برای شناسایی تغییرات ژنتیکی یا جهش‌ها استفاده می‌شود. این روش در تشخیص بیماری‌های ژنتیکی مانند کم‌خونی داسی‌شکل یا بیماری‌های مرتبط با حذف‌های ژنومی کاربرد دارد.

• آنالیز محصولات PCR:

پس از انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)، الکتروفورز ژل آگارز برای بررسی موفقیت واکنش، تعیین اندازه محصولات، و شناسایی آلودگی‌های احتمالی استفاده می‌شود.

• جداسازی DNA برای کلونینگ:

قطعات DNA جدا شده از ژل آگارز می‌توانند برای کاربردهای بعدی مانند کلونینگ یا توالی‌یابی استخراج شوند.

مزایا و محدودیت‌ها

الکتروفورز ژل آگارز روشی ساده، سریع، و مقرون‌به‌صرفه است که نیاز به تجهیزات پیچیده ندارد. با این حال، این روشwater: روش دارای محدودیت‌هایی در وضوح جداسازی است، به‌ویژه برای مولکول‌های کوچک‌تر از ۱۰۰ جفت‌باز، که در این موارد PAGE مناسب‌تر است. همچنین، ژل آگارز برای پروتئین‌ها مناسب نیست، زیرا منافذ آن برای جداسازی دقیق پروتئین‌ها بیش از حد بزرگ هستند.

الکتروفورز پلی‌آکریل‌آمید (PAGE)

الکتروفورز پلی‌آکریل‌آمید (PAGE) به دلیل وضوح بالا و توانایی جداسازی مولکول‌های کوچک‌تر، به‌ویژه برای آنالیز پروتئین‌ها و قطعات کوچک DNA یا RNA استفاده می‌شود. ژل پلی‌آکریل‌آمید از پلیمریزاسیون آکریل‌آمید و بیس‌آکریل‌آمید تشکیل می‌شود و منافذ کوچک‌تری نسبت به آگارز دارد.

اصول و آماده‌سازی PAGE

ژل پلی‌آکریل‌آمید معمولاً به صورت دو لایه تهیه می‌شود: ژل متراکم‌کننده (Stacking Gel) برای فشرده‌سازی نمونه‌ها و ژل جداکننده (Resolving Gel) برای جداسازی مولکول‌ها. غلظت ژل (معمولاً بین ۵ تا ۱۵ درصد) بر اساس اندازه مولکول‌های مورد نظر تنظیم می‌شود. در نوع خاصی از PAGE به نام SDS-PAGE (سدیم دودسیل سولفات-پلی‌آکریل‌آمید ژل الکتروفورز)، پروتئین‌ها با SDS دناتوره شده و بار یکنواختی دریافت می‌کنند، بنابراین جداسازی صرفاً بر اساس اندازه انجام می‌شود.

کاربردهای PAGE

• آنالیز پروتئین‌ها:

SDS-PAGE برای تعیین وزن مولکولی پروتئین‌ها، بررسی خلوص پروتئین‌ها، و شناسایی پروتئین‌های خاص در نمونه‌های پیچیده (مانند عصاره‌های سلولی) استفاده می‌شود. این روش در تحقیقات پروتئومیکس و بررسی بیان پروتئین‌ها در شرایط مختلف (مانند بیماری یا درمان) کاربرد دارد.

• تشخیص بیماری‌های پروتئینی:

PAGE در شناسایی پروتئین‌های غیرطبیعی، مانند پروتئین‌های مرتبط با بیماری‌هایی نظیر آلزایمر یا بیماری‌های پرایونی، استفاده می‌شود.

• آنالیز قطعات کوچک DNA و RNA:

PAGE برای جداسازی قطعات کوچک DNA (مانند محصولات PCR یا الیگونوکلئوتیدها) و RNA (مانند miRNA) مناسب‌تر از ژل آگارز است، زیرا وضوح بالاتری ارائه می‌دهد.

• وسترن بلاتینگ:

پس از جداسازی پروتئین‌ها با SDS-PAGE، می‌توان آن‌ها را به یک غشا (مانند نیتروسلولز) منتقل کرد و با استفاده از آنتی‌بادی‌های اختصاصی، پروتئین‌های خاص را شناسایی کرد. این روش در تشخیص پروتئین‌های بیماری‌زا یا بررسی بیان ژن‌ها بسیار پرکاربرد است.

مزایا و محدودیت‌ها

PAGE وضوح بسیار بالایی در جداسازی مولکول‌های کوچک ارائه می‌دهد و برای آنالیز پروتئین‌ها و قطعات کوچک DNA ایده‌آل است. با این حال، آماده‌سازی ژل پلی‌آکریل‌آمید زمان‌برتر و پیچیده‌تر از ژل آگارز است و نیاز به مواد شیمیایی سمی مانند آکریل‌آمید دارد. همچنین، برای مولکول‌های بسیار بزرگ، مانند DNA ژنومی، ژل آگارز مناسب‌تر است.

 

کاربردهای بالینی و تحقیقاتی الکتروفورز

 

الکتروفورز در حوزه‌های مختلف علمی و پزشکی کاربردهای گسترده‌ای دارد:

تشخیص بیماری‌های ژنتیکی:
الکتروفورز ژل آگارز در شناسایی جهش‌ها یا حذف‌های ژنومی و در روش‌هایی مانند الکتروفورز ژل پالس‌فیلد (PFGE) برای آنالیز DNAهای بزرگ استفاده می‌شود.
تحقیقات پروتئومیکس:
SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ برای مطالعه بیان پروتئین‌ها، شناسایی نشانگرهای زیستی بیماری‌ها، و بررسی برهم‌کنش‌های پروتئینی به کار می‌روند.
تولید دارو و واکسن:
الکتروفورز برای بررسی خلوص پروتئین‌های دارویی، مانند آنتی‌بادی‌های مونوکلونال، یا تأیید کیفیت محصولات بیوتکنولوژی استفاده می‌شود.
تحقیقات میکروبیولوژی:
الکتروفورز در شناسایی سویه‌های باکتریایی یا ویروسی از طریق آنالیز DNA یا پروتئین‌های آن‌ها کاربرد دارد.
پیشرفت‌های اخیر در الکتروفورز
در سال‌های اخیر، پیشرفت‌هایی در تکنیک‌های الکتروفورز ایجاد شده است که کارایی و دقت این روش را بهبود بخشیده است. به عنوان مثال، الکتروفورز مویرگی (Capillary Electrophoresis) امکان جداسازی سریع‌تر و خودکار را فراهم می‌کند و در توالی‌یابی DNA و آنالیز پروتئین‌ها استفاده می‌شود. همچنین، توسعه ژل‌های پیش‌ساخته و سیستم‌های الکتروفورز خودکار، زمان و پیچیدگی آماده‌سازی را کاهش داده است.

محدودیت‌ها و چالش‌ها

با وجود کاربردهای گسترده، الکتروفورز دارای محدودیت‌هایی است. آماده‌سازی ژل‌ها، به‌ویژه در PAGE، می‌تواند زمان‌بر باشد و نیاز به مهارت دارد. همچنین، برای تجزیه و تحلیل کمی دقیق‌تر، تکنیک‌های پیشرفته‌تر مانند کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) یا طیف‌سنجی جرمی ممکن است مورد نیاز باشد. علاوه بر این، رنگ‌آمیزی و شناسایی مولکول‌ها ممکن است به مواد شیمیایی خطرناک نیاز داشته باشد که رعایت نکات ایمنی را ضروری می‌کند.

نتیجه‌گیری
الکتروفورز ژل آگارز و PAGE ابزارهای قدرتمندی در آنالیز DNA و پروتئین‌ها هستند که به دلیل سادگی، دقت، و تطبیق‌پذیری در تحقیقات علمی و تشخیص‌های بالینی جایگاه ویژه‌ای دارند. ژل آگارز برای جداسازی DNA و RNA با اندازه‌های بزرگ‌تر مناسب است، در حالی که PAGE برای پروتئین‌ها و مولکول‌های کوچک‌تر وضوح بالاتری ارائه می‌دهد. این تکنیک‌ها در شناسایی بیماری‌ها، تحقیقات ژنومی و پروتئومی، و توسعه محصولات بیوتکنولوژی نقش کلیدی دارند. با پیشرفت‌های اخیر در فناوری الکتروفورز، این روش همچنان یکی از پایه‌های اصلی در علوم زیستی باقی خواهد ماند.

منابع

Westermeier, R. (2020). Electrophoresis in Practice: A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. Wiley-VCH
Michov B. Electrophoresis fundamentals: essential theory and practice. Walter De Gruyter GmbH & Co KG; 2022 Apr 4